CRISPR: la tecnología de edición genética que podría ser clave para el diagnóstico del coronavirus

Desde el inicio de la pandemia del coronavirus en diferentes ámbitos: diagnóstico, tratamiento o cuidado de los pacientes, entre otros.

La respuesta de la comunidad CRISPR a las nuevas necesidades globales ha sido también inmediata y se han adaptado para proporcionar métodos alternativos de diagnóstico y ofrecer potenciales estrategias terapéuticas.

Esta tecnología es conocida principalmente por su utilización como método para modificar el genoma. No obstante, esa no es su única aplicación. En el contexto de la covid-19 las principales aportaciones basadas en CRISPR se dividen en dos grandes grupos: la detección del virus y el desarrollo de terapias dirigidas a destruir al virus.

Las CRISPR, acrónimo en inglés de 'Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats', o Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas es el nombre de unas secuencias repetitivas presentes en el ADN de las bacterias, que funcionan como autovacunas. Contienen el material genético de los virus que han atacado a las bacterias en el pasado, por eso permiten reconocer si se repite la infección y defenderse ante ella cortando el ADN de los invasores.

Los científicos han aprendido a utilizar la herramienta CRISPR fuera de las bacterias para 'cortar y pegar' trozos de material genético en cualquier célula.

CRISPR utiliza unas guías y una proteína (Cas9) para dirigirse a zonas elegidas del ADN y cortar. A partir de ahí, se pueden pegar los extremos cortados e inactivar el gen, o introducir moldes de ADN, lo que permite editar sus ‘letras’ a voluntad.

Cas9 es una proteína asociada a CRISPR, conocida por actuar como 'tijeras moleculares', que corta y edita, o corrige, en una célula, el ADN asociado a una enfermedad. Un ARN guía dirige las tijeras moleculares Cas9 al lugar exacto de la mutación. Una vez que estas tijeras moleculares hacen un corte en el ADN, los mecanismos celulares adicionales y el ADN añadido de forma exógena utilizarán la maquinaria de la propia célula y otros elementos para 'reparar' específicamente el ADN.

La tecnología CRISPR-Cas9 puede ofrecer la capacidad de modificar o corregir directamente los cambios asociados a la enfermedad subyacente en el genoma, y tiene un gran potencial en medicina, alimentación, agricultura o medio ambiente.

En estos momentos existen dos aproximaciones principales para utilizar CRISPR en la detección del coronavirus SARS-CoV-2. La base metodológica de ambas tecnologías fue desarrollada hace dos años para detectar moléculas de ARN y ADN de forma específica. Recientemente, la pandemia ha impulsado su adaptación a la detección de SARS-CoV-2, una vez se conoció el genoma de este coronavirus.

Según la revista científica Genotipia, la primera aproximación es 'SHERLOCK', desarrollada en el laboratorio de Feng Zhang del Instituto Broad. El funcionamiento es simple. En presencia de la secuencia de ARN a detectar, en este caso un fragmento del ARN del coronavirus, el ARN guía se une a su secuencia diana y activa a la enzima Cas13a, que comienza a degradar el ARN presente en la reacción. Para detectar si el ARN del virus está presente y se produce la degradación de ARN, los investigadores incluyen en la reacción unos pequeños fragmentos de ARN marcados, que al ser degradados emiten una señal que puede ser detectada mediante fluorescencia o reacción colorimétrica.

Tras el inicio de la pandemia y la caracterización del genoma de SARS-CoV-2 los investigadores adaptaron 'SHERLOCK' para poder detectar el coronavirus en aproximadamente una hora. El protocolo utiliza 25 minutos para amplificar los ácidos nucleicos extraídos de la muestra, 30 minutos de incubación con los elementos de CRISPR y los ARNs con la sonda fluorescente y 2 minutos de incubación para obtener la lectura visual de la reacción.

De momento, la detección del coronavirus mediante 'SHERLOCK' no cumple los requisitos para ser utilizado en un contexto clínico, ya que no se ha evaluado en pacientes. Todavía debe ser optimizado y validado para este uso. Sin embargo, sí puede ser utilizado en con fines de investigación.

La segunda tecnología de detección del coronavirus SARS-CoV-2 basada en CRISPR es 'DETECTR', desarrollada inicialmente en el laboratorio de Jennifer Doudna de la Universidad de California en Berkeley.

Un equipo de investigadores de la Universidad de California San Francisco y la empresa Mammoth Biosciences, de la que es cofundadora Jennifer Doudna, ha adaptado 'DETECTR' para detectar SARS-CoV-2. En este caso, al tratarse de un virus de ARN, tras realizar la extracción se realiza un paso previo en el que el ARN de la muestra se copia a ADN y se amplifica. El método DETECTR sí ha sido validado en muestras clínicas de pacientes con diferentes infecciones virales, incluida COVID-19. No obstante, todavía no ha sido aprobada su utilización en diagnóstico clínico por la FDA.

Una de las ventajas de 'SHERLOCK' y 'DETECTR' es que pueden ser utilizados en cualquier laboratorio equipado con instrumental básico. Además, ambos métodos utilizan reactivos diferentes a los de las pruebas basadas en PCR, por lo que representan una alternativa a tener en cuenta cuando hay problemas de disponibilidad de los reactivos necesarios para estas pruebas.

Las herramientas CRISPR también pueden ser utilizadas para detectar y destruir virus de ARN como SARS-CoV2. Una posibilidad sería aprovechar un sistema CRISPR de edición del genoma dirigido a ARN, para modificar el genoma del virus y alterar genes relacionados con su virulencia. Con esta estrategia, el virus quedaría desarmado y pasaría a ser inofensivo.

Otra opción más directa sería atacar y destruir el genoma del virus, aproximación que ya se planteó hace unos meses para hacer frente a otros virus, con resultados prometedores, al menos en cultivo celular.

Unos científicos de la Universidad de Standford han diseñado 'PAC-MAN' (de Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells, o CRISPR antiviral profiláctico en células humanas). Los investigadores han demostrado que 'PAC-MAN' puede ser eficaz frente al virus de la gripe y partículas que simulan el virus SARS-CoV-2. En el experimento, el equipo utilizó una línea de células humanas epiteliales de pulmón modificadas para expresar de forma constante Cas13d a las que añadieron el ARNs guía dirigido frente a virus de ARN. A continuación, comprobaron la capacidad del sistema para inhibir los virus correspondientes. En ambos casos obtuvieron resultados positivos de la acción de 'PAC-MAN' frente al virus.

Los desarrolladores de 'PAC-MAN' han dado incluso un paso más hacia adelante, al identificar seis ARNs guías que reconocen el 90% de los coronavirus que existen. La combinación de estos ARNs guías podría representar una importante oportunidad para responder rápidamente a posibles futuras pandemias causadas por coronavirus emergentes.

Los investigadores reconocen que la estrategia es todavía una prueba de concepto y deberán realizarse pruebas con SARS-CoV-2 infectivos y modelos animales. En cualquier caso, los investigadores destacan que 'PAC-MAN' "representa una aproximación única para implementar en humanos una defensa antiviral rápida y amplia frente a patógenos emergentes para los que no hay vacunas efectivas".