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Las pruebas PCR se han convertido en una herramienta fundamental para determinar el alcance de la pandemia de covid-19 porque son las que ofrecen mayor fiabilidad. Básicamente, consiste en amplificar un fragmento del material genético del paciente para observar si contiene material genético (ARN) del virus SARS-CoV-2.
"Una PCR es una fotografía instantánea en un momento determinado. Lo que 'miramos' en una PCR es si una persona tiene el virus o no en ese momento concreto. Puedes ser negativo al tomarte la muestra y después infectarte", explica la investigadora del CSIC Gemma Rodríguez-Tarduchy.
La prueba PCR es una técnica desarrollada en los años 80 por Kary Mullis, quien posteriormente ganaría el premio Nobel de Química junto a Michael Smith (1993). Consiste en replicar de forma específica el material genético extraído a un paciente hasta obtener millones o miles de millones de copias; es decir, hasta conseguir la cantidad suficiente para analizarlo y para que el resultado de ese análisis tenga un alto grado de fiabilidad. Esta capacidad de amplificación la convierte en una técnica muy útil también en la obtención de un diagnóstico, en análisis criminológicos o en estudios paleontológicos.
El ciclo de las pruebas PCR tiene dos grandes partes: obtención de la muestra y realización del análisis. La obtención se compone de tres pasos: toma de la muestra, inactivación del virus y extracción del material genético. Sólo posteriormente es cuando se realiza la técnica de análisis PCR propiamente dicha.
Primer paso: conseguir la muestra del paciente. El personal sanitario introduce un hisopo (bastoncillo) por la vía nasofaríngea del paciente hasta tomar la muestra. Este hisopo se inserta en un tubo identificado con un código que permite la trazabilidad de la muestra. Además, en su interior, el tubo contiene un líquido que estabiliza la muestra y la conserva.
Segundo paso: inactivar la muestra. Consiste en anular la capacidad contagiosa del virus en un laboratorio de contención biológica de nivel 3. Este paso se realiza en colaboración con el Departamento de Medicina Preventiva, Salud Pública y Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid.
Tercer paso: extraer el material genético. Al ser tomada directamente del paciente, la muestra contiene tanto células del individuo, con sus proteínas, ADN y ARN, como ARN y proteínas virales (en el caso de que la persona esté infectada).
Posteriormente hay que romper la célula infectada y la cápside del virus para liberar su ARN, para cual se emplea una solución (buffer de lisis) que produce la rotura y libera el material genético. El siguiente paso consiste en separar el ARN del resto de componentes celulares.
Para conseguir aislar el material genético (ARN) del resto de elementos entran en escena dos robots especializados que posee el Instituto de Investigaciones Biomédicas 'Alberto Sols' (IIBM) gracias a una donación de la empresa Alantra. Estos permiten procesar, en algo más de una hora, 96 muestras de manera simultánea.
Análisis PCR: tras tomar la muestra, inactivar el virus y extraer su material genético, llega el momento realizar la prueba PCR. Para desarrollar esta última fase, las muestras se trasladan unos pocos metros hasta el laboratorio de genómica del IIBM. En esta nueva ubicación y haciendo alusión únicamente a la duración de la técnica PCR, el resultado de las muestras se obtiene en 45 minutos.
Convertir ARN en ADN (RT-PCR): Para amplificar el material genético es necesario utilizar la enzima ADN polimerasa. Sin embargo, esta enzima solo actúa sobre ADN (doble cadena de nucleótidos) mientras que la muestra obtenida es ARN (una cadena de nucleótidos). Ello hace que sea necesario convertir el ADN en ARN complementario. Este proceso se conoce como retrotranscripción y se lleva a cabo gracias a una enzima conocida como transcriptasa reversa.
La enzima polimerasa produce millones de copias: Una vez que la transcriptasa ha generado la cadena de ADN, que es complementaria a la cadena de ARN del virus, funciona como un molde del material genético del virus. A ese molde se le añade entonces ADN polimerasa, una enzima (catalizador biológico) que, mediante varios ciclos con cambios periódicos de temperatura, realiza millones de copias para amplificar el material genético del virus.
Sondas fluorescentes que revelan tres genes del SARS-CoV-2: durante esta fase el objetivo es identificar el virus amplificando de forma específica tres secuencias específicas del ARN del coronavirus. Para determinar la presencia de los genes se usan oligonucleótidos específicos para secuencias del genoma de SARS-CoV-2. En la misma reacción se incluyen sondas fluorescentes específicas de las regiones amplificadas. La fluorescencia emitida se detecta en el mismo momento que se realiza la prueba gracias a equipos de PCR más sofisticados que se conocen como equipos de PCR a tiempo real. "Si detectamos emisión de fluorescencia de los tres fluorocromos en la muestra, ésta es positiva. En caso contrario consideramos la muestra como negativa", indica Rodríguez-Tarduchy.
Como la fluorescencia generada revela la presencia de tres secuencias virales simultáneamente, la PCR proporciona un alto grado de fiabilidad, obviando de forma importante lo que se conocen como falsos positivos. Con el diagnóstico finaliza un proceso que hoy en día se conoce coloquialmente como PCR. Si desde el principio hasta el final se desarrolla de manera secuencial, el procedimiento apenas se prolonga 24 horas.